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質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌實驗操作步驟
點擊次數(shù):1313 更新時間:2023-06-01

該實驗主要有兩個用途:
1.重組質(zhì)粒的鑒定。當(dāng)質(zhì)粒的重組或其它載體重組后,通常會發(fā)生質(zhì)粒的重組失敗,包括質(zhì)粒的自身環(huán)化。因而要求進行篩選,把重組成功的質(zhì)粒找出來。在目前常用的質(zhì)粒和其它載體中含有相應(yīng)的抗生素抗性基因,一旦重組成功,質(zhì)粒環(huán)化(包括自身環(huán)化),抗生素抗性基因表達,被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌便具備抗相應(yīng)抗生素的能力,可以含該抗生素的培養(yǎng)基中生長傳代,不然,重組失敗,大腸桿菌便不能抵抗該抗生素而死亡。

2.為擴增質(zhì)粒和其它載體作準(zhǔn)備。由于大腸桿菌繁殖快,在適宜的條件下繁殖一代僅需要20~30分鐘,而且常用質(zhì)??梢栽诖竽c桿菌中達到幾百個拷貝,因此,通過對轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌培養(yǎng),可以在短時內(nèi)極大地擴增目的質(zhì)粒。(作為分子生物學(xué)用大腸桿菌,是經(jīng)過實驗室改造過的工程菌。)

實驗原理
本實驗通過CaCl2對特定的大腸桿菌處理,制備感受態(tài)的細菌。這些細菌可使每微克超螺旋質(zhì)粒DNA,如一些插入目的DNA片段的重組質(zhì)粒,產(chǎn)生5×106~2×107個轉(zhuǎn)化的菌落。當(dāng)質(zhì)粒與這些大腸桿菌混合后,質(zhì)粒粘附在大腸桿菌的表面,在42℃的溫度時,大腸桿菌出現(xiàn)熱休克,質(zhì)??赏ㄟ^大腸桿菌細胞膜上形成的空隙進入菌體內(nèi)。隨后,加入LB培養(yǎng)液,于37℃振動培養(yǎng)可使細菌復(fù)蘇,并且表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因,提高轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌可以在相應(yīng)抗生素培養(yǎng)皿中傳代,形成菌落。

實驗準(zhǔn)備
一.器材
天平、秤量匙、秤量皿
加熱磁力攪拌器、攪拌子
可調(diào)移液器P1000、P200、P20及其經(jīng)消毒的盒裝藍、黃吸頭
經(jīng)消毒的1.5ml Eppendorf管、試管架及其水浴用試管架
定時器、記號筆、一次性手套和筒紙
42℃恒溫水浴
4℃和-70℃冰箱
煤氣燈或酒精燈
恒溫培養(yǎng)搖床(調(diào)至37℃,225rpm)
37℃培養(yǎng)箱
玻璃涂棒(普通玻璃吸管,細頭部在煤氣燈上燒成“L"形)
消毒過的潔凈培養(yǎng)皿(直徑10cm)

二.試劑
LB培養(yǎng)基
細菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨10g
細菌培養(yǎng)用酵母提取物5g
NaCl 5g

加800ml水,放入磁力攪拌棒,在磁力攪拌器上攪拌至徹di溶解,用5M NaOH(約0.2 ml)調(diào)節(jié)pH值至7.0,加水定容至1000 ml。高壓15 lbf/in2(1.034×105pa)消毒30分鐘,冷卻后可加入氨芐青霉su(50mg/ml)500ul,視載體特性而定,混勻,即為含抗生素的LB培養(yǎng)液。存放于避光處。

含有瓊脂的培養(yǎng)基
即在以上1000ml培養(yǎng)基中加入15g細菌培養(yǎng)用瓊脂。

抗生素瓊脂平板
待含有瓊脂的培養(yǎng)基冷卻后,加入抗生素,傾入培養(yǎng)皿,約30~50 ml,用煤氣燈火焰掠過培養(yǎng)基表面,以消除氣泡。冷卻后,標(biāo)記,封于塑料袋中,倒置,于4℃冰箱內(nèi)避光保存。

pH試紙(或pH計)

三.實驗材料
來源于實驗一的重組質(zhì)粒
受感態(tài)大腸桿菌
碎冰及碎冰保溫盛器

實驗步驟
自-70℃冰箱中取出受感態(tài)大腸桿菌,插入濕冰中溶解約15分鐘,輕輕混勻。吸取50ul移入1.5ml管,并立刻將細菌放回-70℃冰箱。
細菌50 ul
DNA 5 ul
輕輕混勻,靜置冰上30分鐘。
于42℃水浴中熱休克細菌45秒,迅速移入濕冰中,靜置2分鐘,加入900ul LB培養(yǎng)液,放入37℃恒溫箱搖床,225rpm搖晃培養(yǎng)1小時。取50ul涂于含氨卞青霉su的LB瓊脂平板皿上,待干燥后,倒置,存放于37℃的培養(yǎng)箱中過夜。
次日,檢查各培養(yǎng)皿中是否出現(xiàn)菌落。

實驗結(jié)果
轉(zhuǎn)化成功,培養(yǎng)皿中可見散在的菌落。
轉(zhuǎn)化失敗,培養(yǎng)皿上無菌落,或菌落布滿如苔樣,后者提示可能是抗生素濃度不夠或失效。

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