分析蛋白純化方法及其優(yōu)缺點(diǎn)

    1.蛋白沉淀蛋白能溶于水是因為其表面有親水性氨基酸，在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)處若溶液的離子強(qiáng)度特別高或者特別低，蛋白則傾向于從溶液中析出。硫酸銨是沉淀蛋白zui常用的鹽，因為它在冷的緩沖液中溶解性好，冷的緩沖液有利于保持目的蛋白的活性。

    2.緩沖液的更換雖然更換緩沖液不能提高蛋白純度，但它卻在蛋白純化方案中起著極其重要的作用。不同的蛋白純化方法需要不同pH及不同離子強(qiáng)度的緩沖液。假如你用硫酸銨將蛋白沉淀出來，毫無疑問蛋白是處在高鹽環(huán)境中，需要想辦法脫鹽，可用的方法有利用半透膜透析，通過勤換透析液體去除鹽分，此法尚可，但需幾個小時，通常要過夜，也難以用予大規(guī)模純化中。

    3.離子交換色譜這是在所有的蛋白純化與濃縮方法中zui有效方法?；诘鞍着c離子交換樹脂間的相互電荷作用，通過選擇不同的緩沖液，同一種蛋白既可以和陰離子交換樹脂(能結(jié)合帶負(fù)電荷的分子)結(jié)合，也可以和陽離子交換樹脂結(jié)合。樹脂所用的帶電基團(tuán)有四種：二乙基氨基乙基用于弱的陰離子交換樹脂；羧甲基用于弱的陽離子交換樹脂；季銨用于強(qiáng)陰離子交換樹脂；甲基磺酸酯用于強(qiáng)陽離子交換樹脂。蛋白質(zhì)由氨基酸組成，氨基酸在不同的pH環(huán)境中所帶總電荷不同。

    4.親和層析親和層析基于目的蛋白與固相化的配基特異結(jié)合而滯留，其他雜蛋白會流過柱子。本方法存在的問題是：單抗非常昂貴，而且也需先純化；單抗與目的蛋白結(jié)合力太強(qiáng).要用苛刻的條件來洗脫，這會使目的蛋白失活并破壞單抗；混合物中的其他蛋白如蛋白酶也可能破壞抗體或與它們非特異結(jié)合；

    5.疏水作用層析蛋白是由疏水性和親水性氨基酸組成的。疏水性氨基酸位于蛋白空間結(jié)構(gòu)的中心部位，遠(yuǎn)離表面的水分子。親水性氨基酸殘基則位于蛋白表面。由于親水性氨基酸吸引了許多的水分子，所以通常情況下整個蛋白分子被水分子包圍著，疏水性氨基酸不會暴露在外。在高鹽濃度的環(huán)境中蛋白的疏水性區(qū)域則會暴露并與疏水性介質(zhì)表面的疏水性配基結(jié)合。不同的蛋白疏水性不同，與疏水作用力大小也不同，通過逐漸降低緩沖液中鹽濃度沖洗柱子，在鹽濃度很低時，蛋白恢復(fù)自然狀態(tài)，疏水作用力減弱被洗脫出來。

    6.排阻層析也叫凝膠過濾或分子篩。排阻層析柱的填充顆粒是多孔的介質(zhì)，柱中圍繞著顆粒所能容納的液體量叫流動相，也稱無效體積。太大的蛋白不能進(jìn)入顆粒的孔內(nèi)，只能存在于無效體積的溶液中，將會zui早從柱中洗脫出來，對這部分蛋白無純化效果。