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瓊脂糖凝膠電泳的制備及核酸檢測
點(diǎn)擊次數(shù):455 更新時(shí)間:2022-04-14

 一. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

1、掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理;

2、學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳的操作。

二. 實(shí)驗(yàn)原理

瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子,沸水中溶解,45℃開始形成多孔性剛性濾孔,凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。

DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷,在外加電場作用下向正極泳動(dòng)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí),有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA,其分子量大小及構(gòu)型不同,電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同,從而分出不同的區(qū)帶。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA,主要是利用分子篩效應(yīng),遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。

溴化乙錠(EB)未扁平狀分子,在紫外照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復(fù)合物,其發(fā)射的熒光強(qiáng)度較游離狀態(tài)EB發(fā)射的熒光強(qiáng)度大10倍以上,且熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比。

三、儀器和試劑

儀器: 微量移液器,電泳儀,電泳槽,微波爐

試劑: 瓊脂糖:1.0%;電泳緩沖液(50 × TAE 電泳緩沖液取Tris24.2g ,冰/醋酸5.7ml , 0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml ,加蒸餾水至100ml ) EB:5 ?l / 100 ml TBE

電泳材料:標(biāo)準(zhǔn)分子量核酸(DL2000)

四. 操作步驟

(1)制膠(以20 mL為例)

a. 稱取0.2 g 瓊脂糖,加入20 ml 的1XTAE緩沖液(pH 8.0),搖勻;

b. 微波爐加熱,至瓊脂糖*溶解(要防止過熱溢出三角瓶);

c.將制膠板放入制膠槽中,插入適當(dāng)?shù)氖嶙樱瑢⑷芙獾沫傊牵s50℃)加入2ul EB后,混均勻,倒入其中,直至厚度為4~6 mm(如有氣泡要把氣泡趕出),在室溫下冷卻凝固(約30~ 45 min);

d.小心垂直向上拔出梳子,以保證點(diǎn)樣孔完好,將膠板置于電泳槽中。

(2)點(diǎn)樣

用微量移液器將5 ?l含藍(lán)色染液的 DL2000 加入點(diǎn)樣孔下部。

(3)電泳

打開電源開關(guān),調(diào)節(jié)電壓至3~5 V/cm(約100 V),可見到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動(dòng),約30-40分鐘后即可觀察結(jié)果。

(4)觀察

將電泳好的膠置于紫外透射檢測儀上,打開紫外燈,可見到橙紅色核酸條帶,根據(jù)條帶粗細(xì),可粗略估計(jì)該樣品DNA的濃度。如同時(shí)有已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA進(jìn)行電泳,則可通過線性DNA條帶的相對(duì)位置初步估計(jì)樣品的分子量。

五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

點(diǎn)樣時(shí)效果較好的照片點(diǎn)出的白色熒光線比較亮,條帶粗細(xì)均勻;條帶沒有出現(xiàn)兩端粗中間細(xì)的情況

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